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Liste des Publications

 

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Liste des Publications

 

 

 

 

La génétique somatique

Travaux de R&D portant sur la Génétique Somatique

La génétique somatique est en pleine évolution, tant au niveau technique qu'au niveau de ses applications, avec une participation de plus en plus importante à la médecine personnalisée concernant en particulier les choix thérapeutiques.

Projet : « Evaluation des kits de détection de mutations somatiques sur les gènes BRAF, EGFR, KRAS »

En effet, depuis quelques années des Autorisations de Mise sur le Marché (AMM) conditionnelles associent le traitement proposé au patient à la composante génétique de la tumeur de ce dernier. Il faut donc étudier de plus près les mutations portées par différents gènes en fonction de la pathologie concernée tel que les gènes KRAS et BRAF dans les cancers colorectaux, EGFR et KRAS dans les cancers broncho-pulmonaire, et BRAF dans les mélanomes.

De nombreux industriels ont mis au point des kits « prêt à l'emplois » pour répondre à cette demande.

Cette étude a pour but de comparer les performances des kits produits par Roche et Qiagen ainsi que la pertinence clinique des mutations détectées selon le contexte pathologique étudié. La comparaison a également été effectuée avec les résultats obtenus par la méthode de référence par séquençage Sanger.

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L'objectif à terme est de déterminer si ces kits apportent la même information, s'ils sont complémentaires, ou s'ils ne sont pas adaptés pour certains cas. En effet dans le cadre de l'activité de génétique somatique de routine pratiquée au laboratoire il est essentiel d'évaluer ces paramètres pour chaque approche afin d'en déterminer les limites et de valider ou de réorienter notre choix de technologie, afin de répondre aux attentes des oncologues.

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Ce travail a déjà donné lieu à une communication dans un congrès national, une publication des premiers résultats est en préparation.

Compagnone M., Camus C., Halfon P. Evaluation des kits de détection de mutations somatiques sur les gènes BRAF, EGFR, KRAS

L’infection par le HPV

Travaux de R&D portant sur : l'infection par le PapillomaVirus Humain (HPV)

Le cancer invasif du col (ICC) de l'utérus occupe le 2ème rang en fréquence des cancers de la femme dans le monde avec près de 500 000 nouveaux cas en 2005, ayant provoqué près de 260 000 décès. L'ICC constitue la première cause de mortalité par cancer dans les pays en voie de développement. Au sein de l'Union Européenne, 30 400 femmes sont touchées et la mortalité est estimée à 4,7 %.

En France, les recommandations en vigueur concernant la conduite à tenir après un frottis cervico-utérin (FCU) anormal (ANAES de 2002) et concernant l'indication du test HPV (actualisation de l'HAS 2010) n'indiquent le test HPV qu'en seconde intention, et ce dans deux situations précises : la prise en charge d'un FCU de type ASCUS (Atypical Squamous Cell of Undetermined Significance) chez la femme de plus de 30 ans et dans le cadre de la surveillance post-thérapeutique des CIN2-3.

Projet « HPV milieux » : Evaluation de milieux de conservation et/ou de transport avec le test Cobas 4800 HPV (Roche)

La majorité des techniques de recherche des HPV sont réalisées à partir d'un frottis cervico-utérin. Les FCU sont aujourd'hui majoritairement conditionnés en phase liquide.

D'après une étude de 2012 réalisée par le Centre National de Référence, près de la moitié des laboratoires de Biologie médicale pratiquent des examens de détection et/ou de génotypage des HR dans des conditions qui ne sont pas conformes au Guide de Bonne Exécution des Analyses (GBEA). Dans le contexte d'accréditation selon la norme ISO 15189 (norme internationale publiée par l'ISO en 2012 qui spécifie les exigences de qualité et de compétence propres aux laboratoires de biologie médicale), notre laboratoire a été confronté à la réception de prélèvement dont la nature ne correspondait pas aux milieux validés par le fournisseur. L'accréditation du paramètre « Détermination de la présence d'HPV oncogènes » depuis 2012 dans notre laboratoire, nous imposait donc le refus de prélèvements réalisés sur des milieux autres que PreservCyt (ThinPrep, Hologic Incorporated, MA, USA) ou SurePath (BD Diagnostics-TriPath).

L'objet de notre étude était donc d'évaluer les principaux milieux de conservation et/ou de transport de cellules du col de l'utérus dont l'utilisation n'est pas décrite dans la fiche technique du test Cobas® 4800 HPV (Roche) qui représente le test diagnostic utilisé en routine dans notre laboratoire.

 

Les résultats obtenus et la valorisation du projet sont décrits dans une publication parue dans une revue française à destination des gynécologues et laboratoires d'analyses médicales :

Khiri H, Camus C, Portugal M, Pénaranda G, Boyer S, Halfon P. Cytological and virological medium performance and stability assessment using the Cobas 4800 HPV test (Roche Diagnostics) used in France. Ann Biol Clin (Paris). 2014 Mar-Apr;72(2):213-23.

 

Projet « DIAPO » : Détection de l'Intégration de l'ADN des Papillomavirus Oncogènes

L'infection persistante par des génotypes d'HPV oncogènes (à haut risque, HR) est considérée comme la principale cause de lésions pré-invasives et invasives du col utérin. On estime que 100% des cancers invasifs contiennent du matériel génétique de l'HPV (ADN sous forme épisomale ou intégrée), l'intégration du matériel génétique du virus HPV étant une étape importante dans la progression tumorale.

Le cancer du col peut être prévenu par la détection des lésions qui le précèdent, d'où la nécessité d'un dépistage performant. Aujourd'hui, d'un point de vue cytologique, le dépistage, le diagnostic et le suivi des patientes reposent sur 1) le frottis, 2) la colposcopie, et 3) la biopsie. En complément, il existe différents tests moléculaires dits tests HPV.

Dans l'hypothèse actuelle de l'utilisation du test HPV en première intention de dépistage, il devra être complété par un test de deuxième génération ciblant les patientes infectées par un HPV avec un risque élevé d'évolution cancéreuses.

La vaccination ne préviendra qu'environ 70% des cas de cancer du col utérin [8] et ses effets sur l'incidence de ce cancer ne seront mesurables que dans plusieurs décades obligeant à un suivi et un criblage à long terme. La valeur prédictive positive de la cytologie diminuera; des tests HPV seront alors nécessaires au contrôle des femmes vaccinées, pour surveiller l'évolution de l'épidémiologie de l'infection HPV dans la population après la vaccination ou bien l'incidence de l'infection HPV chez les femmes vaccinées, afin de déterminer la durée d'efficacité des vaccins.

De nombreux arguments plaident en faveur du développement de tests visant à l'amélioration du diagnostic et du pronostic spécifiques des HPV à HR et plus particulièrement des types 16, 18, 33 et 45. Le projet portera donc sur la mise au point d'un outil et ç terme d'un test diagnostique innovant pour la détection/la quantification et la qualification de l'intégration de ces 4 génotypes.

Ce travail a déjà donné lieu à plusieurs communications dans des congrès internationaux, une publication des premiers résultats est en préparation.

L’Infection par le VHB

Travaux de R&D portant sur : l'infection par le Virus de l'Hépatite B (VHB)

Avec 350 millions de porteurs chroniques dans le monde, soit environ 5 % de la population mondiale, le virus de l'hépatite B est un problème majeur de santé publique.

Projet « DBS » : Etude clinique multicentrique, prospective, avec bénéfice direct, du dépistage de l'hépatite B au moyen d'une méthode non invasive (sang séché sur papier filtre) sur une population exposée au VHB

Ce projet s'inscrit dans le cadre du Plan national hépatites 2009-2012 lancé en 2009 par le ministère de la santé.

Le premier objectif de ce projet est de valider la technique de détection des marqueurs VHB sur des papiers buvards (DBS : Dried Blood Spot).

Le second objectif est le dépistage du VHB en utilisant cette méthode non-invasive, d'une population exposée, disposant d'un mauvais accès aux soins.

Et enfin le dernier objectif serait de pouvoir proposer la vaccination aux personnes VHB négatifs et une prise en charge de l'infection aux personnes VHB positives.

 

Ce travail a déjà donné lieu à une communication dans un congrès international ainsi qu'à une publication dans une revue internationale :

Mohamed S, Raimondo A, Pénaranda G, Camus C, Ouzan D, Bourlière M, Khiri H, Dukan P, Olive D, Halfon P. Dried blood spot sampling for hepatitis B virus serology and molecular testing. PLoS One. 2013 Apr 16;8(4):e61077.

 

Projet « Antigène HBs (AgHBs)»

L'hépatite chronique B (HCB) avec négativité de l'antigène HBe (AgHBe) est actuellement le type prédominant de HCB en Europe et dans le bassin méditerranéen. A ce jour, deux classes de médicaments ont été approuvées pour le traitement de l'HCB : l'interféron pégylé alpha, et les inhibiteurs de la réplication virale (i.e. analogues nucléosi(ti)diques (AN)). Les AN oraux requièrent une thérapie longue et à durée indéterminée. Idéalement le traitement de l'HCB a pour but d'enrayer le virus de l'hépatite B, mais ceci est difficile à atteindre avec les thérapies actuellement disponibles. Ainsi il est important de découvrir de nouvelles thérapies entrainant une négativation de l'AgHBs, permettant au patient l'arrêt de son traitement.

La réduction de l'AgHBs par traitement par AN n'est pas aussi prononcée qu'un traitement par interféron. Des études récentes ont montré un déclin plus important de l'AgHBs en combinant l'interféron pégylé et les AN, mais la durée optimale de traitement reste inconnue. Dans ce contexte, aucune étude n'a évalué l'effet de l'adjonction d'interféron pégylé pendant 96 semaines en se basant sur la surveillance du titrage AgHBs.

Plusieurs objectifs ont été fixés :

  • Evaluer si l'adjonction d'une cure de 96 semaines d'interféron pégylé à un traitement par analogues nucléosi(ti)diques permet d'obtenir une perte de l'AgHBs. Cette évaluation s'effectue sur un groupe de patients AgHBs positifs et AgHBe négatifs.
  • Observer le titrage AgHBs durant la thérapie interféron administrée pour le traitement de l'hépatite chronique delta, et à adapter la durée du traitement basée sur le titrage AgHBs. Cette observation s'effectue sur un groupe de patients infectés par l'hépatite chronique delta et AgHBe négatifs.
  • Réaliser une enquête nationale afin de décrire un état des lieux de la connaissance de la prescription de la quantification de l'AgHBs en pratique de routine, et de connaitre les indications de prescription selon le mode d'exercice ainsi que l'analyse des barrières à la non prescription. Cette enquête sera réalisée sur 135 hépato-gastroentérologues exerçant dans différentes structures de soins (secteur public, privé, ou hôpital périphérique).

Ce travail a déjà donné lieu à deux communications dans des congrès internationaux ainsi qu'à deux publications dans des revues internationales :

Ouzan D, Pénaranda G, Joly H, Khiri H, Pironti A, Halfon P. Add-on peg-interferon leads to loss of HBsAg in patients with HBeAg-negative chronic hepatitis and HBV DNA fully suppressed by long-term nucleotide analogs. Journal of Clinical Virology 58 (2013);713-717.

Ouzan D, Pénaranda G, Joly H, Halfon P. Optimized HBsAg titer monitoring improves interferon therapy in patients with chronic hepatitis delta. Journal of Hepatology 2013;58:1258-1266.

L’Infection par le VHC

Travaux de R&D portant sur : l'infection par le Virus de l'Hépatite C (VHC)

L'infection liée au virus de l'hépatite C (VHC) est un problème majeur de santé publique qui concerne 3% de la population mondiale et représente une des premières causes de cirrhose et de carcinome hépatique.

Projet « IL-28B » : Etude prospective multicentrique de la distribution du polymorphisme de l'IL-28B chez les patients atteints d'hépatite chronique C de génotype 1 et 4.

De nombreuses études récentes ont démontré une association entre le polymorphisme de l'interleukine 28B (IL-28B) et l'élimination du VHC après traitement.
Actuellement les tests de génotypage classique de l'IL-28B sont réalisés à partir de prélèvements sanguins (analyse sur sang total et/ou sur cellules mononuclées périphériques). Il existe cependant de nouvelles techniques non invasives, par exemple, les tests salivaires endo-buccaux, notamment utilisés pour les empreintes génétiques.

L'utilisation d'un test non invasif (test salivaire endo-buccal) permettrait de faciliter la détection du polymorphisme IL-28 chez les patients dont l'accès veineux est limité voire absent (ie : toxicomane, travailleurs du sexe, prisonniers...).

L'objectif principal de ce travail a été d'évaluer les avantages de l'utilisation d'une technique non invasive par prélèvement salivaire dans le cadre de la détection de variations génétiques sur le gène de l'IL-28. Et d'autre part d'étudier au moyen de cette méthode la distribution du génotype de l'IL28B dans la population de patients infectés par le VHC.

 

Ce travail a donné lieu à de plusieurs communications dans des congrès internationaux ainsi qu'à deux publications dans des revues internationales :

Halfon P, Ouzan D, Khiri H, Pénaranda G, Castellani P, Oulès V, Kahloun A, Amrani N, Fanteria L, Martineau A, Naldi L, Bourlière M. Detection of IL28B SNP DNA from buccal epithelial cells, small amounts of serum, and dried blood spots. PLoS One. 2012;7(3):e33000.

Halfon P, Ouzan D, Asselah T, Renou C, Allègre T, Delasalle P, Lafeuillade A, Cadranel JF, Haddad N, Khiri H, Pénaranda G, Bourlière M; Iliade Investigators. Impact of IL28B on the treatment decision in naïve and experienced patients with genotype 1 and 4 chronic hepatitis C in real-life clinical practice: A prospective multicenter cohort. Clin Res Hepatol Gastroenterol. 2014 Jul 14. pii: S2210-7401(14)00149-1.

 

Projet « Q80 » : Mise en place d'un test de prédisposition (Q80) à la réponse à un traitement chez les patients infectés par le VHC génotype 1a exclusivement : test compagnon thérapeutique

Ce travail va donner lieu à une publication dans les mois à venir.

L'infection par le VIH

Travaux de R&D portant sur : l'infection par le Virus de l'Immunodéficience Humaine (VIH)

Le VIH est un rétrovirus infectant l'homme et responsable du syndrome d'immunodéficience acquise (SIDA), qui est un état affaibli du système immunitaire le rendant vulnérable à de multiples infections opportunistes. A cause de sa variabilité génétique la population de virus produite lors de la réplication virale est hétérogène, et on parle alors de "quasi-espèces virales". Les quasi-espèces contiennent ainsi une hétérogénéité de souches virales que l'on peut classer en un groupe dominant majoritaire et en plusieurs groupes minoritaires.

La découverte de médicaments antiviraux contre la cible spécifique des enzymes clés du virus constitue un des défis importants de ce siècle. Toutefois, ces avancées sont limitées par le développement de la résistance aux médicaments. Par conséquent, la détermination de profils de résistance est obligatoire dans le traitement des infections virales chroniques, en particulier dans le cas d'échec du traitement.

 

Projet « PyroSeq » : Développement d'une méthode de détection des résistances aux traitements anti-rétroviraux chez des patients infectés par le VIH par pyroséquençage

Notre objectif a été de mettre au point un nouveau kit pour détecter la résistance aux traitements antirétroviraux contre le VIH, basée sur la technologie du pyroséquençage et adaptée à la détection de faible quantité de variants viraux du VIH résistants aux médicaments. La sensibilité du pyroséquençage est suffisante pour les besoins cliniques, même si elle reste moindre par rapport à l'Ultra Deep Sequencing (UDS).

Le kit sera plus adapté que les kits actuellement disponibles sur le marché, il permettra d'améliorer la sensibilité par rapport aux méthodes de Sanger, aura un coût moins élevé et une approche plus simple à utiliser que les kits UDS-base sur une plate-forme technologique plus légère.

Le kit développé s'adresse aux marchés du diagnostic in vitro pour le diagnostic et le traitement du VIH. Les cliniciens disposeront en routine d'un outil convivial pour la détection des souches résistantes du VIH présents en faible quantité et pour l'analyse de leur intérêt clinique pour traitement du patient.

 

Ce travail a donné lieu à une publication dans un journal international :

Mohamed S, Ravet S, Camus C, Khiri H, Olive D, Halfon P. Clinical and analytical relevance of NNRTIs minority mutations on viral failure in HIV-1 infected patients. J Med Virol. 2014 Mar;86(3):394-403.

 

Projet « UDS » : Séquençage à haut débit sur des patients atteints du VIH

Il y a une nécessité à développer un kit de diagnostic avec une meilleure sensibilité que celle de la méthode de séquençage historique (Sanger) et d'intégrer un logiciel capable d'interpréter les résultats des résistances, de prédire l'évolution des populations virales et, par conséquent, d'adapter au mieux les traitements antirétroviraux. Le couplage de cet essai avec les informations bio-informatiques conduirait à une interprétation des données par les cliniciens facilitée et de meilleure qualité.

Le premier objectif de ce projet a été d'évaluer le séquençage à haut débit en utilisant le GS Junior (Roche 454 Life Sciences Branford, CT), avec un nouveau protocole visant à détecter et quantifier les variantes mineures et majeures de la protéase et la réverse transcriptase des VIH-1 génotypes A, B, C, F et G.
Le deuxième objectif a été de comparer les trois algorithmes d'interprétation les plus utilisés (ANRS, HIVdb et Rega). Enfin, les données de résistance générées avec le logiciel DeepChek ®-VIH ont été comparées selon le seuil de sensibilité choisi (≥ 1% et ≥ 20%).

 

Ce travail a donné lieu à plusieurs communications dans des congrès internationaux ainsi qu'à une publication dans une revue internationale :

Mohamed S , Penaranda G, Gonzalez D, Camus C, Khiri H, Boulmé R, Sayada C, Philibert P, Olive D and Halfon P. Comparison of Ultra Deep Versus Sanger Sequencing for detection of minority mutations after virological failure and consequences on HIV Drug Resistance genotype interpretation. AIDS. 2014 Apr.